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默克生命科学
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默克与您携手抗疫——病毒疫苗收获液澄清与核酸去除工艺开发
人阅读 发布时间：2020-05-11 17:26
在病毒疫苗的澄清工艺中，除了滤器的载量会作为重要的考察因素外，病毒回收率也十分重要。根据病毒的带电性和粒径特点，在病毒收获液的澄清中往往会选择低吸附的深层滤器，如默克 Millistak+® CE 系列深层滤器；或玻璃纤维/混合纤维素酯材料的表面滤器，如 PolysepTM II。这样的滤器选择在保证澄清效果的同时也维持了很高的回收率。
下面让我们来看看 COVID-19 同源病毒或工艺相近的病毒澄清和核酸去除工艺的应用。
悬浮细胞 Coronavirus 疫苗病毒澄清工艺
Coronavirus 为包膜病毒，粒径 75-160nm。
选择深层过滤器 Millistak+® CE50 做为一级滤器，表面过滤器 PolysepTM II 2.0/1.2um 作为二级滤器进行澄清时，料液浊度可以从 100NTU 以内的初始值降低至 20NTU 以下。同时滤器的载量可以达到 400L/m2 以上，回收率>90%。
▲图 1. Coronavirus 澄清过滤中 CE50 和 PolysepTM II 的载量与回收率
Millistak+® CE系列深层滤器的填充材料为纤维素，从 23 cm2 到 1.1m2 规格，覆盖小试到大规模生产，简化您的澄清工艺。作为一款高颗粒物容纳，低残留体积的深层滤器，CE50 的孔径约 0.6-1um，适用于细胞密度、浊度较低的收获液澄清，对于病毒类产品，可以保证很高的回收率。而 PolysepTM II 表面滤器的材质为玻璃纤维/混合纤维素酯，兼具深层滤器的高颗粒物容纳特性和膜滤器的截留能力，同样具有低吸附的特点，常用的规格有 2.0/1.2um、1.0/0.5um、1.0/0.2um 等，可作为低浊度料液的澄清滤器，或者在培养基、中间产品等料液的除菌过滤步骤前用作保护性滤器。良好的可放大性，支持小试工艺开发到大规模生产应用。
▲图 2. 不同规格的 Millistak+® Pod 深层过滤器和 PolysepTM II 表面过滤器图
Vero 细胞微载体悬浮培养条件下的病毒澄清工艺
在 Vero 细胞微载体悬浮培养的包膜病毒疫苗澄清工艺中，考虑到简化工艺步骤和优越的浊度控制，我们使用了具有较强吸附能力的深层滤器Millistak+® HC Pro C0SP，当高载量使用时（500L/m2以上），总回收率则达到 90%，浊度 20NTU以内。可见虽然 C0SP 吸附能力很强，但由于其同时具有高载量的特点，从而保证了较高的回收率。
▲图 3. 微载体 Vero 细胞生产包膜病毒澄清工艺中 C0SP 滤器载量和产品回收率图
Millistak+® HC Pro 系列深层滤器，用合成材质聚丙烯酸纤维和二氧化硅代替了传统的硅藻土和纤维素，在单抗和疫苗澄清中，载量通常是传统深层滤器的两倍以上。同时由于人工合成材质相比传统材质更为清洁，在工艺放大后，可以节省大量的冲洗用水，节约成本和时间。通常 C0SP 用于高密度细胞收获液的单级澄清。
▲图 4. 不同规格的 Millistak+® HC Pro 深层过滤器图
腺病毒病毒澄清工艺
腺病毒病毒广泛应用于疫苗和基因治疗领域，在腺病毒的澄清工艺中，默克不同系列的深层滤器在高细胞密度和裂解细胞的情况下都能到达良好的澄清效果，并保持很高的回收率。下图是 Millistak+® HC 和 Millistak+® HC Pro 系列滤器在腺病毒澄清中的常规表现。
▲图 5. AAV 澄清工艺中 Millistak+® HC 和 Millistak+® HC Pro 深层过滤器载量和产品回收率
在病毒疫苗工艺中，核酸残留是客户非常关心的质控指标。Benzonase® 核酸内切酶不但可以对料液中的核酸进行高效切割，并且内切酶和切割后核酸碎片可以在下游工艺中的超滤步骤轻松除去，无残留风险。
Benzonase® 核酸内切酶在病毒载体疫苗中的应用
对于 Vero、CHO 等细胞表达的疫苗类生物制品，残余 DNA 含量通常被限定为<100 或 10pg/剂。Benzonase® 核酸内切酶可以在 37°C 条件下，迅速将料液中的核酸切割成 3-8bp 的片段，从而大幅降低工艺过程中的核酸残留，使得 DNA 残余量达到要求。这些切割后的片段和 Bensonase® 内切酶可以在下游的 300kD 超滤中轻松去除。试验数据表明，在经过 8 个 CV 的透析换液之后，残留的核酸片段和内切酶可以达到 99.9% 的去除率。
下图可见，经过 4 min 反应后，Bensonase® 内切酶对于核酸的切割效率。
▲图 6. 宿主 DNA 经 Benzonase® 核酸内切酶反应后琼脂糖凝胶电泳图
在病毒疫苗的澄清工艺中，根据不同的细胞培养方式、病毒类型、病毒原液收获模式，默克Millistak+® Pod 深层滤器和 PolysepTM II 表面滤器都可以很好的满足工艺需求，并可实现从小试到生产线性放大。而非动物源 Bensonase® 核酸内切酶，能简单快速地降低工艺过程中核酸残留，为疫苗安全性提供了强有力的保障。
▲图 7. 不同型号与规格的 Millistak+® Pod 深层过滤器
下面让我们来看看 COVID-19 同源病毒或工艺相近的病毒澄清和核酸去除工艺的应用。
悬浮细胞 Coronavirus 疫苗病毒澄清工艺
Coronavirus 为包膜病毒，粒径 75-160nm。
选择深层过滤器 Millistak+® CE50 做为一级滤器，表面过滤器 PolysepTM II 2.0/1.2um 作为二级滤器进行澄清时，料液浊度可以从 100NTU 以内的初始值降低至 20NTU 以下。同时滤器的载量可以达到 400L/m2 以上，回收率>90%。
▲图 1. Coronavirus 澄清过滤中 CE50 和 PolysepTM II 的载量与回收率
Millistak+® CE系列深层滤器的填充材料为纤维素，从 23 cm2 到 1.1m2 规格，覆盖小试到大规模生产，简化您的澄清工艺。作为一款高颗粒物容纳，低残留体积的深层滤器，CE50 的孔径约 0.6-1um，适用于细胞密度、浊度较低的收获液澄清，对于病毒类产品，可以保证很高的回收率。而 PolysepTM II 表面滤器的材质为玻璃纤维/混合纤维素酯，兼具深层滤器的高颗粒物容纳特性和膜滤器的截留能力，同样具有低吸附的特点，常用的规格有 2.0/1.2um、1.0/0.5um、1.0/0.2um 等，可作为低浊度料液的澄清滤器，或者在培养基、中间产品等料液的除菌过滤步骤前用作保护性滤器。良好的可放大性，支持小试工艺开发到大规模生产应用。
▲图 2. 不同规格的 Millistak+® Pod 深层过滤器和 PolysepTM II 表面过滤器图
Vero 细胞微载体悬浮培养条件下的病毒澄清工艺
在 Vero 细胞微载体悬浮培养的包膜病毒疫苗澄清工艺中，考虑到简化工艺步骤和优越的浊度控制，我们使用了具有较强吸附能力的深层滤器Millistak+® HC Pro C0SP，当高载量使用时（500L/m2以上），总回收率则达到 90%，浊度 20NTU以内。可见虽然 C0SP 吸附能力很强，但由于其同时具有高载量的特点，从而保证了较高的回收率。
▲图 3. 微载体 Vero 细胞生产包膜病毒澄清工艺中 C0SP 滤器载量和产品回收率图
Millistak+® HC Pro 系列深层滤器，用合成材质聚丙烯酸纤维和二氧化硅代替了传统的硅藻土和纤维素，在单抗和疫苗澄清中，载量通常是传统深层滤器的两倍以上。同时由于人工合成材质相比传统材质更为清洁，在工艺放大后，可以节省大量的冲洗用水，节约成本和时间。通常 C0SP 用于高密度细胞收获液的单级澄清。
▲图 4. 不同规格的 Millistak+® HC Pro 深层过滤器图
腺病毒病毒澄清工艺
腺病毒病毒广泛应用于疫苗和基因治疗领域，在腺病毒的澄清工艺中，默克不同系列的深层滤器在高细胞密度和裂解细胞的情况下都能到达良好的澄清效果，并保持很高的回收率。下图是 Millistak+® HC 和 Millistak+® HC Pro 系列滤器在腺病毒澄清中的常规表现。
▲图 5. AAV 澄清工艺中 Millistak+® HC 和 Millistak+® HC Pro 深层过滤器载量和产品回收率
在病毒疫苗工艺中，核酸残留是客户非常关心的质控指标。Benzonase® 核酸内切酶不但可以对料液中的核酸进行高效切割，并且内切酶和切割后核酸碎片可以在下游工艺中的超滤步骤轻松除去，无残留风险。
Benzonase® 核酸内切酶在病毒载体疫苗中的应用
对于 Vero、CHO 等细胞表达的疫苗类生物制品，残余 DNA 含量通常被限定为<100 或 10pg/剂。Benzonase® 核酸内切酶可以在 37°C 条件下，迅速将料液中的核酸切割成 3-8bp 的片段，从而大幅降低工艺过程中的核酸残留，使得 DNA 残余量达到要求。这些切割后的片段和 Bensonase® 内切酶可以在下游的 300kD 超滤中轻松去除。试验数据表明，在经过 8 个 CV 的透析换液之后，残留的核酸片段和内切酶可以达到 99.9% 的去除率。
下图可见，经过 4 min 反应后，Bensonase® 内切酶对于核酸的切割效率。
▲图 6. 宿主 DNA 经 Benzonase® 核酸内切酶反应后琼脂糖凝胶电泳图
在病毒疫苗的澄清工艺中，根据不同的细胞培养方式、病毒类型、病毒原液收获模式，默克Millistak+® Pod 深层滤器和 PolysepTM II 表面滤器都可以很好的满足工艺需求，并可实现从小试到生产线性放大。而非动物源 Bensonase® 核酸内切酶，能简单快速地降低工艺过程中核酸残留，为疫苗安全性提供了强有力的保障。
▲图 7. 不同型号与规格的 Millistak+® Pod 深层过滤器
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