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默克生命科学
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上海 浦东新区
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抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒、试剂、耗材、实验室仪器 / 设备
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公司新闻/正文
默克为您提供PCR精选试剂,从核酸抽取到PCR检测,满足您各方所需。
人阅读 发布时间:2020-08-07 11:17
手把手教你攻克PCR困难模板
我太“南”了
PCR算是实验室最磨练耐心的实验之一了,好不容易完成了样品准备、核酸的提取,然而PCR之后没有产物,是漏加了试剂,还是酶失活?换上新试剂,格外小心,重来一次,没用啊!,依然P不出条带。内心无比凄凉,悲伤逆流成河。
本来做个PCR研究都够难了,现在还偏要碰到“困难模板”,小白不哭,没有条带不要着急,学姐总结经验,带你攻克各路PCR困难模板。
高GC含量模板
难点
DNA序列中,G-C之间的三对氢键通常需要较高能量解链,模板很难打开,易形成复杂的二级结构,DNA聚合酶难以推进。因此高GC含量(G+C>=60%)DNA序列在常规PCR条件下比较难扩增。
解决方案
长片段模板
难点
长片段DNA序列在PCR过程中易损伤,使其断裂或脱嘌呤,导致长片段PCR无法进行。Taq酶具有一定的错配率,导致产物链3‘端出现错配碱基,链合成提前终止。非特异性扩增也会干扰长片段的延伸。
解决方案
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低纯度模板
难点
低纯度模板中可能含有PCR抑制剂残留,如蛋白酶K、苯.酚和EDTA;残留的盐分或离子,如K+,Na+等也可能会抑制DNA聚合酶,从而影响PCR扩增。
解决方案
低浓度模板
难点
模板浓度是决定Ct的最主要因素,需控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。低浓度模板不仅会影响PCR效率降低得率,甚至无扩增产物。
解决方案
产品推荐
工欲善其事,必先利其器,做PCR的小伙伴,快快选取以下利器,帮助你攻克PCR模板难题,实验加速度吧~
链接:https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/promotions/pcr-promotion.html?utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat
我太“南”了
PCR算是实验室最磨练耐心的实验之一了,好不容易完成了样品准备、核酸的提取,然而PCR之后没有产物,是漏加了试剂,还是酶失活?换上新试剂,格外小心,重来一次,没用啊!,依然P不出条带。内心无比凄凉,悲伤逆流成河。
本来做个PCR研究都够难了,现在还偏要碰到“困难模板”,小白不哭,没有条带不要着急,学姐总结经验,带你攻克各路PCR困难模板。
高GC含量模板
难点
DNA序列中,G-C之间的三对氢键通常需要较高能量解链,模板很难打开,易形成复杂的二级结构,DNA聚合酶难以推进。因此高GC含量(G+C>=60%)DNA序列在常规PCR条件下比较难扩增。
解决方案
- 选用专门针对GC-RICH PCR系统试剂盒:
包含高合成能力的DNA聚合酶,这类酶对DNA模板的亲和力较高,更适合扩增困难靶标 - 添加1~2M betaine:
betaine在PCR混合液里可以保护DNA聚合酶免被高温变性伤害,还能促进DNA-蛋白质复合物的稳定,提高扩增效率。 - 添加2~5% DMSO:
DMSO可以降低DNA的二级结构。但DMSO也会降低Taq polymerase的活性,因此DMSO的使用浓度需要优化。
货号 | 产品描述 | |
12140306001 | GC-RICH PCR System | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/12140306001?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
KK5702 | 2G Robust Hot Start Readymix | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/2grhsrmkb?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
B0300 | Betaine solution | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIGMA/B0300?lang=en®ion=US&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
D8418 | DMSO for molecular biology | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIGMA/D8418?lang=en®ion=US&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
长片段模板
难点
长片段DNA序列在PCR过程中易损伤,使其断裂或脱嘌呤,导致长片段PCR无法进行。Taq酶具有一定的错配率,导致产物链3‘端出现错配碱基,链合成提前终止。非特异性扩增也会干扰长片段的延伸。
解决方案
- 使用专为长片段PCR设计的PCR系统试剂盒:包含兼具矫正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶,这类酶能够在短时间内扩增长片段。
- 设计较长的长片段PCR引物(21~34bp),提高反应特异性,减少错配率。
- 适当降低延伸温度,同时根据模板长度加长延伸反应时间(通常1kb/min)。
- 缓冲液体系需提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力,使缓冲液的pH不会降的过低而影响酶活性。
产品推荐
货号 | 产品描述 | |
D1313 | JumpStart™ REDAccuTaq® LA DNA Polymerase | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/D1313?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
11732650001 | Expand High Fidelity PCR System | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/ehifiro?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
11681834001 | Expand™ Long Template PCR System | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ROCHE/ELONGRO?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
低纯度模板
难点
低纯度模板中可能含有PCR抑制剂残留,如蛋白酶K、苯.酚和EDTA;残留的盐分或离子,如K+,Na+等也可能会抑制DNA聚合酶,从而影响PCR扩增。
解决方案
- 选择合成能力高,对抑制剂耐受力高的DNA聚合酶,比如,把野生型Ta酶通过Directed Evolution工程化修饰的KAPA2G DNA聚合酶。
- 使用70%乙醇再纯化DNA,去除残留盐分或离子。
- 把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
- 若存在EDTA或其它金属螯合剂时,需要适当提高能与EDTA结合的 Mg2+浓度。
货号 | 产品描述 | |
KK5024 | KAPA2G Robust PCR Kit | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ROCHE/2GRKB?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
KK7252 | KAPA3G Plant PCR Kit | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/3gphskb?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
4655885001 | Transcriptor One-Step RT-PCR Kit | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/tosrtro?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
低浓度模板
难点
模板浓度是决定Ct的最主要因素,需控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。低浓度模板不仅会影响PCR效率降低得率,甚至无扩增产物。
解决方案
- 选择高灵敏度,高合成能力的DNA聚合酶。
- 避免样制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
- 再次扩增PCR产物,得到更高的目标DNA得率。
- PCR扩增无产物时,可以适当提高Mg2+浓度(终浓度范围:1~4 mM)。
产品推荐
工欲善其事,必先利其器,做PCR的小伙伴,快快选取以下利器,帮助你攻克PCR模板难题,实验加速度吧~
链接:https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/promotions/pcr-promotion.html?utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat